泳動結果
Myelin basic protein (MBP)の
MAPキナーゼによる in vitro kinase assayです
リン酸基供与体として，ATPあるいは，ATP-γSを用いています。
ATP-γSは，ATPアナログとして，キナーゼアッセイに用いられます。
基質は，チオリン酸化体となります。
チオリン酸基を検出する優れた方法(WB)があり，非RIの観点からも汎用されます。
しかし，ATP-γSはATPの代替として，本当に同等であるかは検討されていませんでした。
MAPK kinase assayにおいて，MAPKによる両者の利用効率を比較しました。
Mn2+–, Zn2+– どちらのPhos-tag SDS-PAGEでも，
リン酸基と同様に，チオリン酸基も分離・検出可能です。
しかし，それぞれとの親和性に違いがあり，シフトアップの度合いは異なります。
(矢印で示したように，位置が違います）
ATP-γSを用いた場合，ATPを用いた場合よりも，
シフトアップするバンドの濃度が薄く，リン酸化の効率が悪いと言えます。
用いた基質がどれだけリン酸化，あるいはチオリン酸化したかを
定量してその割合をグラフにすると次のようになります。
なお，▷で示した上方のバンドは，非特異的なリン酸化産物です。
リコンビナントキナーゼを用いたkinase assay では，よく見られます。
宿主由来のキナーゼが混じっているのではないか？と推察されます。
反応時間が長くなるにつれて，ほとんどの基質が，▷に収束してしまいます。
Phos-tag を使わない（RIなど）キナーゼアッセイでは
偽陽性と気づかないまま，酵素活性として理解される恐れがあります。
関連画像
Abl/Abltide-GST kinase assay (ATPγSを用いた場合)
PKA/histone H1 kinase assay (ATPγSを用いた場合)